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    品質(zhì)保證 · 通蔚試劑

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    • 小鼠Flag標(biāo)簽(Flag-tag)ELISA試劑盒

      規(guī)格：
      價(jià)格：￥
      • 品牌 : 通蔚生物
      • 目錄號 : TW7409
      • 應(yīng)用 : 僅限于科研使用
      • 英文名 ：Mouse Flag-tag ELISA KIT
      • 貨期 : 現(xiàn)貨
      • 靈敏度 ：0.06ng/mL
      • 規(guī)格 ：48T/96T
      • 檢測范圍 ：0.125 ~ 8ng/ml
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    簡介
    FLAG標(biāo)簽，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一種多肽蛋白質(zhì)標(biāo)簽，可以用重組DNA技術(shù)添加到蛋白質(zhì)中，其序列圖案為DYKDDDDK（其中D=天冬氨酸，Y=酪氨酸，K=賴氨酸），它是最特異的標(biāo)簽之一，是一種通用種屬工抗原，已經(jīng)開發(fā)出特異的、高親和力的單克隆抗體，因此可用于親和層析法的蛋白質(zhì)純化，也可用于定位活細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，它已被用于分離重組的、過量表達(dá)的蛋白和宿主生物體表達(dá)的野生型蛋白，它還可用于分離具有多個(gè)亞單位的蛋白質(zhì)復(fù)合物，因?yàn)槠錅睾偷募兓^程往往不會破壞這種復(fù)合物，它已被用于獲得足夠純度和質(zhì)量的蛋白質(zhì)，以通過X射線晶體學(xué)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)測定，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可用于許多需要抗體識別的不同檢測中，如果沒有針對某一特定蛋白的抗體，在蛋白上添加FLAG標(biāo)記，就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白，例如通過免疫熒光、免疫沉淀或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測進(jìn)行細(xì)胞定位研究，從N端到C端的FLAG標(biāo)簽的肽序列是，DYKDDDDK（1012Da），此外，它還可以串聯(lián)使用，常見的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK（最后一個(gè)標(biāo)簽編碼一個(gè)腸激酶裂解位點(diǎn)），它可以與蛋白質(zhì)的C端或N端融合，或插入到蛋白質(zhì)內(nèi)，一些市售的抗體（如 M1/4E11）只有在N端出現(xiàn)時(shí)才能識別該表位，然而，其他可用的抗體（如M2）則對位置不敏感，F(xiàn)LAG標(biāo)簽中的酪氨酸殘基可以被硫酸化，這可能會影響抗體對FLAG表位的識別，F(xiàn)LAG標(biāo)簽可以與其他親和力標(biāo)簽一起使用，例如多組氨酸標(biāo)簽（His標(biāo)簽）、HA標(biāo)簽或myc標(biāo)簽。
    檢測原理
    本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測物Flag-tag，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中Flag-tag的濃度。
    需要的其他材料
    1.  酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時(shí)包含600-680nm校正波長更佳；
    2.  移液器及槍頭；
    3.  蒸餾水或去離子水；
    4.  100-1000 mL刻度量筒；
    5.  洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
    6.  水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
    7.  用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
    樣品保存
    樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
    試劑準(zhǔn)備工作
    使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
    洗滌液/稀釋液配置
    如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
    標(biāo)準(zhǔn)品配置

    試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從160ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至8ng/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的8ng/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將8ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 8ng/mL、 4ng/mL、 2ng/mL、 1ng/mL、 0.5ng/mL、 0.25ng/mL、 0.125ng/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ng/mL)。

    小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

    抗體工作液配置
    使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
    酶結(jié)合物工作液配置
    使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
    備 注：如待測樣本中Flag-tag濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
    結(jié)果的計(jì)算
    計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
    若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
    示例數(shù)據(jù)
    以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)

    8

    4

    2

    1

    0.5

    0.25

    0.125

    0

    OD值

    2.553

    1.616

    1.08

    0.653

    0.385

    0.269

    0.189

    0.061

    校正OD值

    2.492

    1.555

    1.019

    0.592

    0.324

    0.208

    0.128

    0








    下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果

    小鼠(Flag-tag) ELISA試劑盒

    重復(fù)性
    板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
    靈敏度
    經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.06ng/mL。
    特異性
    該試劑盒測定可識別重組小鼠Flag-tag。
    其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。